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Il film racconta le disavventure che si verificano ogni notte al Museo Americano di Storia Naturale quando il sole tramonta. Il lavoro estivo di Nick Daley come guardiano notturno del museo è un impiego impegnativo per uno studente delle superiori, ma il ragazzo sta seguendo le orme del padre ed è determinato a non deluderlo. Fortunatamente, conosce l’antica tavoletta del museo che dà vita a tutto quando il sole tramonta ed è felice di rivedere al suo arrivo i suoi vecchi amici, tra cui Jedediah, Octavius e Sacagawea. Ma quando il sovrano Kahmunrah fugge con lo scopo di riaprire il mondo sotterraneo e liberare l’Esercito dei Morti, spetta a Nick fermare il folle imperatore e salvare il museo una volta per tutte.